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建站基础:wordpress安装教程图解 - 天缘博客,网站订单系统模板,sdk软件开发工具包,怎么做网站文字优化一、靶向PGK1抑制糖酵解-激酶双功能调控巨噬细胞炎症因子表达及其在结肠炎治疗中的潜力 糖酵解代谢酶通过感知代谢状态变化#xff0c;在免疫代谢领域发挥关键调控作用。磷酸甘油酸激酶1#xff08;PGK1#xff09;作为糖酵解途径中的关键催化酶#xff0c;其功能调控受到…一、靶向PGK1抑制糖酵解-激酶双功能调控巨噬细胞炎症因子表达及其在结肠炎治疗中的潜力糖酵解代谢酶通过感知代谢状态变化在免疫代谢领域发挥关键调控作用。磷酸甘油酸激酶1PGK1作为糖酵解途径中的关键催化酶其功能调控受到广泛关注。本研究首先构建了高通量筛选平台成功鉴定出一种新型PGK1抑制剂DC-PGKI。该抑制剂以ATP竞争性方式结合PGK1解离常数Kd为99.08 nmol/L表现出高亲和力。研究证实DC-PGKI在体外及体内均能稳定PGK1蛋白水平并有效抑制其糖酵解活性与激酶功能。进一步研究发现DC-PGKI可显著影响脂多糖LPS刺激下巨噬细胞的炎症应答具体表现为抑制白细胞介素-1βIL-1β和白细胞介素-6IL-6的产生。机制研究表明抑制PGK1可导致核因子E2相关因子2NRF2由NFE2L2基因编码在细胞内积累并促进其向细胞核转位。进入细胞核的NRF2能够结合于*Il-1b*与*Il-6*基因的邻近调控区域从而抑制LPS诱导的上述基因转录表达。在疾病模型中应用DC-PGKI干预能有效缓解葡聚糖硫酸钠DSS诱导的小鼠结肠炎症状。上述结果不仅证实了PGK1在巨噬细胞炎症反应中的关键调节作用也揭示了靶向PGK1开发抑制剂为炎症性肠病等炎症性疾病提供潜在治疗策略的科学依据。二、基于反向偶联反应的PGK1高通量筛选平台建立与抑制剂鉴定为筛选靶向PGK1的小分子抑制剂本研究建立了一种基于酶偶联反应的高通量检测平台。该平台利用PGK1与甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH共同催化的可逆反应特性通过监测NADH在340 nm处的吸光度变化间接反映PGK1的催化活性。具体而言在含有3-磷酸甘油酸3-PG、ATP、NADH及过量GAPDH的反应体系中加入PGK1可启动逆反应生成1,3-二磷酸甘油酸1,3-BPG后者立即被GAPDH还原并伴随NADH消耗从而实现对PGK1酶动力学的实时监测图1A。首先对从大肠杆菌表达系统纯化的重组PGK1进行酶学表征其动力学参数1,3-BPG的Km 189.4 ± 4.8 μmol/LATP的Km 1.30 ± 0.11 mmol/LKcat 956 ± 41.7 s⁻¹与已报道的人源PGK1数据一致。经条件优化最终确定反应体系中PGK1与GAPDH的最佳浓度分别为0.40 nmol/L与0.10 μmol/L以保证GAPDH始终处于过量状态。该检测体系在验证中显示出良好的稳定性与重现性其Z因子为0.54符合高通量筛选要求图1B。利用该平台对内部化合物库进行初步筛选在单剂量50 μmol/L条件下选取抑制率高于50%的化合物进行剂量-反应分析并进一步通过GAPDH单独催化实验排除非特异性干扰分子。最终鉴定出包括dorsomorphin、purvalanol A、MK-571及LTP-10在内的多个PGK1抑制剂其IC50值介于1.96至25.24 μmol/L之间图1C–D。其中purvalanol A的抑制活性IC50 1.96 μmol/L与文献报道一致证实了本筛选体系的可靠性。为进一步探究其作用机制选取具有新颖化学结构的LTP-10进行深入分析。酶动力学研究表明LTP-10对底物3-PG表现为非竞争性抑制而对ATP则呈现竞争性抑制模式其Ki值为2.59 ± 0.01 μmol/L图1E–F。此外热稳定性实验表明LTP-10可显著提高PGK1的热变性温度提示其可能通过结合并稳定PGK1蛋白构象发挥抑制作用。以上结果验证了该筛选平台在发现与表征PGK1抑制剂方面的有效性与应用价值。三、DC-PGKI通过靶向PGK1抑制巨噬细胞炎性因子IL-1β与IL-6的表达代谢重编程在免疫细胞炎症应答中发挥关键作用尤其与有氧糖酵解过程密切相关。先前研究表明糖酵解酶PKM2可通过磷酸化STAT3等信号分子促进白细胞介素-1βIL-1β与白细胞介素-6IL-6的表达其小分子抑制剂在多种炎症模型中显示出治疗潜力。受此启发本研究探讨了另一关键糖酵解酶PGK1是否在巨噬细胞炎症调控中具有类似功能。本研究利用PGK1抑制剂DC-PGKI作为化学探针在脂多糖LPS刺激的RAW264.7细胞及原代骨髓来源巨噬细胞BMDM中评估其对炎性因子表达的影响。结果显示DC-PGKI以浓度依赖性方式显著抑制LPS诱导的*Il-1b*与*Il-6*的mRNA表达图4A–B并降低其蛋白水平图4C而对肿瘤坏死因子-αTNF-α的表达无显著影响。与已知糖酵解抑制剂2-DG及PKM2特异性抑制剂TEPP-46/DASA-58相比DC-PGKI对IL-1β与IL-6均具有抑制作用提示其作用机制可能不仅限于干扰糖酵解代谢途径。为进一步验证DC-PGKI的作用依赖于PGK1本研究通过RNA干扰技术敲低巨噬细胞中PGK1的表达。结果显示PGK1敲低可模拟DC-PGKI的效应显著抑制IL-1β与IL-6的产生图4E–G且不影响TNF-α表达。此外在PGK1敲低细胞中回补表达siRNA抗性的PGK1蛋白可恢复IL-1β与IL-6的表达水平图4H表明DC-PGKI对炎性因子的抑制作用是经由PGK1介导的。综上本研究证实PGK1在巨噬细胞炎症应答中具有重要调控功能其抑制剂DC-PGKI可通过靶向PGK1选择性抑制IL-1β与IL-6的表达为炎症性疾病的靶向治疗提供了新的实验依据。四、DC-PGKI通过KEAP1-NRF2通路抑制IL-1β与IL-6表达既往研究提示抑制PGK1可能影响KEAP1的翻译后修饰从而促进核因子E2相关因子2NRF2的积累及其下游抗氧化基因的转录。类似地内源性代谢物衣康酸可通过修饰KEAP1激活NRF2并发挥抗炎作用。基于此本研究进一步探讨DC-PGKI是否通过调控NRF2通路介导其抗炎效应。结果表明DC-PGKI处理可呈时间与浓度依赖性地下调KEAP1蛋白水平并相应增加NRF2蛋白表达及其经典下游靶基因血红素加氧酶1HMOX1的mRNA与蛋白水平图5A–C。在脂多糖LPS刺激与否的条件下DC-PGKI均能显著上调包括Txnrd1、Prdx1、Gclc、Sod1等在内的多个NRF2调控基因的表达图5E–H。此外在293T细胞中进行的NRF2依赖性荧光素酶报告基因实验进一步证实DC-PGKI可激活NRF2转录活性图5D。在KEAP1突变或缺失的细胞系中DC-PGKI未引起NRF2积累表明其作用具有KEAP1依赖性。为明确NRF2在DC-PGKI抑制炎性因子表达中的作用机制本研究通过染色质免疫沉淀-定量PCRChIP-qPCR分析发现经DC-PGKI处理后NRF2在Il-1b、Il-6及经典靶基因Nqo1启动子邻近区域的结合显著增强图6I–K而对照基因血栓烷合酶Txs内含子区未见明显变化。综上所述DC-PGKI可通过降低KEAP1蛋白稳定性促进NRF2核转位及其与靶基因启动子的结合从而抑制IL-1β与IL-6的表达。该结果揭示了PGK1抑制剂调控炎症反应的一条新机制即通过激活KEAP1-NRF2抗氧化通路实现抗炎作用。五、总结本研究围绕糖酵解关键酶PGK1在巨噬细胞炎症反应中的调控作用展开系统性探索。首先成功构建了基于反向酶偶联反应的高通量筛选平台并鉴定出新型ATP竞争性抑制剂DC-PGKI。该抑制剂不仅有效抑制PGK1的糖酵解与激酶双功能更通过靶向PGK1选择性抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β和IL-6表达而对TNF-α无显著影响。进一步机制研究表明DC-PGKI通过促进KEAP1降解激活NRF2信号通路增强NRF2核转位及其与*Il-1b*、*Il-6*基因启动子区域的结合从而在转录水平抑制炎症因子表达。最终在DSS诱导的结肠炎模型中DC-PGKI展现出明确的治疗潜力。本研究成果不仅揭示了PGK1在免疫代谢调控中的新功能也为其作为炎症性疾病如炎症性肠病的治疗靶点提供了理论与实验依据。原文点击PGK1作为炎症调控新靶点DC-PGKI通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞炎症反应